KLONING PENGANTAR BIOTEKNOLOGI PERTANIAN.

Bagikan di Facebook

Bagikan di Twitter

Untuk mempelajari kloning gen dibutuhkan penge -tahuan tentang konsep biologi molekuler dan peng -gunaan tehnik-tehnik dalam laboratorium
Baca Juga Di Potret Pertanian

Tips Pertanian

1. Bongkar Tips Ampuh Agar Tanaman Buah Di Dalam Pot Bisa Cepat Berbuah
2. Cara Atasi Busuk Daun Tanaman Tomat Di Musim Penghujan
3. Cara Budidaya Dan Mengendalikan Hama Penyakit Pada Tanaman Kacang Tanah
4. Cara Paling Ampuh Agar Hasil Cangkokan Cepat Berakar
5. Marfologi Kacang Hijau dan Cara Menanam Dengan Baik dan Benar
6. Tips Mudah Mengetahui Tanah Asam

Teknologi DNA telah meluncurkan revolusi dalam bidang bioteknologi yaitu manipulasi organisme atau komponen organisme untuk melakukan tugas tugas praktis untuk menghasilkan produk yang bermanfaat.

Semuanya melibatkan para peneliti dari bidang a.l; biologi, mikrobiologi, biologi molekuler,dan para teknisi peralatan untuk menunjang kerja para peneliti.

Aplikasi DNA Rekombinan

Dalam Bidang Kedokteran

Dalam Bidang Farmasi

Dalam Bidang Forensik

Dalam Bidang Lingkungan

Dalam Bidang Pertanian

Dalam Bidang pangan

DNA REKOMBINAN (KLONING GEN)

KONJUGASI, TRANSFORMASI, TRANSDUKSI

Perpindahan molekul genetik dari satu sel bakteri ke sel bakteri lainnya secara kontak antar sel.

Sel donor akan memberikan informasi genetik kepada resipien.

Plasmid akan mengontrol formasi filamen permukaan sel yang dibutuhkan untuk mengadakan kontak pada waktu terjadinya perkawinan.

Konjugasi

Plasmid memiliki sistim khusus untuk replikasi dan transfer DNA plasmid dan sistem pengontrolan

Plasmid memiliki faktor F yang merupakan faktor konjugatif ,

Konjugasi

Transformasi

Prosesperpindahan genetik dimana sel resipien membutuhkan molekul DNA bebas ( DNA yang berada diluar sel atau yang telah dimurnikan.

Dalam laboratorium transformasi dapat dilakukan dengan mengisolasi DNA donor kemudian menambahkannya pada suspensi selresipien.

Transformasi dapat terjadi secara alami.

Pada prinsipnya transformasi akan terjadi bila sel resipien mampu menerima DNA yang telah diisolasi dari sel donor.

Transformasi dapat terjadi pada bakteri Gram positif ataupun Gram negatif

Transformasi dapat dipindahkan dari sel bakteri kepada sel tanaman.

Transformasi

Transduksi

Adalah transfer genetik dari sel ke sel oleh virus dari sel inang .

Transduksi terbagi 2

Tranduksi Khusus : hanya terjadi pada beberapa virus tertentu.gen inang langsung diintegrasi kedalam genomvirus.lalu ditransfer ke resipien selama proses lisogenisasi (pembentukan lisogen )

Lisogen adalah bakteri yang mengandung faga lengkap

Transduksi umum : gen gen inang yang berasal dari suatu genom akan menjadi bagian dari partikel DNA virus yang sudah matang darisuatu tempat atau penambahan pada genom virus.

Virus yang telah mengalami transduksi tidak mampu melisiskan inang. Hal ini disebabkan sel bakteri telah menggantikan tempat penting pada gen virus.

Transduksi

KLONING DNA

ENZIM RESTRIKSI (enzim pemotong)

KLONING VEKTOR (pembawa)

ENZIM LIGASE yang berfungsi menyambung rantai DNA, dan enzim lain, seperti alkalin fosfatase, DNA polimerase, reverse transkriptase, dan polinukleotida kinase

KOMPONEN UNTUK KLONING DNA

Pemotongan DNA (DNA organisme yang diteliti dan DNA vektor) dengan enzim restriksi

Penyambungan potongan-potongan (fragmen) DNA organisme dengan DNA vektor menggunakan enzim ligase

Transformasi rekombinan DNA (vektor + DNA sisipan) dalam sel bakteri Escherichia coli

Seleksi untuk mendapatkan klon DNA yang diinginkan

PROSES DASAR KLONING DNA

ENZIM RESTRIKSI

▲ Adalah : Enzim yang dapat mengkatalisasi pembelahan / pe

motongan DNA dibeberapa tempat / lokasi spesifik

dengan jumlah yang terbatas & dapat direproduksi.

▲ Enzim ini disebut juga dengan nama endonuklease restriksi

( Russell, 1980).

▲ Semua enzim ini mampu memecah ikatan fosfodiester asam nukleat umumnya berupa tangga, karena urutan target umumnya sering muncul berkali kali.

▲ fragmen enzim restriksi berupa DNA untai ganda dengan sedikitnya satu ujung untai tunggal.

Stewart Linn & Werner Arber (1960)

Menemukan : Enzim modifikasi maupun enzim nuklease “restriksi” dalam bakteri E.coli galur B yang dapat menguraikan DNA yang tidak termetilkan.




Hamilton Smith (1970)

Pertama kali menemukan enzim nuklease restriksi spesifik yang memutus DNA pada tempat- tempat tertentu dan dapat diidentifikasikan, dari Haemophilus influenzae yang dikenal dengan nama HindII,

SEJARAH PENEMUAN ENZIM RESTRIKSI

Watson dkk, (1983)

Menemukan nuklease restriksi & metilase modifikasi dalam dua galur E.coli lain yang membuka kemungkinan adanya banyak nuklease yang spesifik untuk suatu tempat

SEJARAH PENEMUAN ENZIM RESTRIKSI

ENZIM RESTRIKSI

Disebut endonuklease

Memotong rantai ganda DNA pada tempat tertentu

Cara kerjanya dengan mengenal sekuens (urutan basa) tertentu pada DNA, lalu melakukan pemotongan

Sekuens pengenal berbeda antara satu enzim restriksi dengan yang lain

Lebih dari 200 enzim restriksi telah diidentifikasi dan diisolasi

Enzim restriksi golongan I bekerja dengan mengenal sekuens tertentu pada DNA, tetapi melakukan pemotongan di luar (disekitar) sekuens pengenal tersebut

Enzim restriksi golongan II, memotong DNA pada posisi tertentu di dalam sekuens pengenal

Enzim restriksi golongan III, pemotongan tidak spesifik dilakukan di sekitar sekuens pengenal

ENZIM RESTRIKSI

GOLONGAN ENZIM RESTRIKSI

ENZIM RESTRIKSI

Nama enzim restriksi diambil dari nama bakteri asal enzim tersebut diisolasi

Bakteri umumnya mensintesis satu atau lebih endonuklease yang dapat memotong DNA

Endonuklease atau enzim restriksi berfungsi terutama menghalangi adanya DNA-DNA asing yang masuk ke dalam sel bakteri tersebut

DNA dari sel yang mensintesis enzim restriksi itu sendiri terlindungi dari aksi enzim restriksinya karena sel tersebut juga mensintesis enzim modifikasi yang merubah struktur dari sekuens pengenal enzim restriksi

ENZIM RESTRIKSI

Contoh enzim restriksi, organisme asal mereka diisolasi, dan sekuens pengenal

Nama

Mikroorganisme Asal

Sekuens Pengenal

AluI

Arthrobacter luteus

A – G – C – T

T – C – G – A

BamHI

Bacillus amyloliquefaciens H

G – G – A – T – C – C

C – C – T – A – G – G

EcoRI

Escherichia coli RY13

G – A – A – T – T – C

C – T – T – A – A – G

HaeIII

Haemophilus aegiptius

G – G – C – C

C – C – G – G

PvuII

Proteus vulgaris

C – A – G – C – T – G

G – T – C – G – A – C

SalI

Streptomyces albus G

G – T – C – G – A – C

C – A – G – C – T – G

SmaI

Serratia marcescenc Sb

C - C – C – G – G – G

G – G – G – C – C – C

HindIII

Haemophilus influenzae Rd

A – A – G – C – T – T

T – T – C – G – A – A

ENZIM RESTRIKSI

SEKUENS PENGENAL ENZIM RESTRIKSI YANG TELAH DIKETAHUI ADA 4, 6, DAN 8 PASANG BASA

CIRI LAIN SEKUENS PENGENAL ENZIM RESTRIKSI ADALAH SIFATNYA YANG PALINDROMIK (JIKA DITARIK GARIS SUMBU DI TENGAH-TENGAH SEKUENS PENGENAL, MAKA URUTAN BASANYA SIMETRI

SEKUEN PENGENAL

BamHI 5’ -------G * G – A – T – C – C --------------------------- 3’

3’ -------C – C – T – A – G * G --------------------------- 5’

EcoRI 5’ -------G * A – A – T – T – C --------------------------- 3’

3’ -------C – T – T – A – A * G --------------------------- 5’

HaeIII 5’ ------------------ G – G – C – C --------------------------- 3’

3’ ------------------ C – C – G * G --------------------------- 5’




SEKUEN PENGENAL

ENZIM RESTRIKSI

ENZIM RESTRIKSI

ENZIM RESTRIKSI MEMOTONG IKATAN FOSFODIESTER PADA TULANG PUNGGUNG RANTAI DNA

HASIL PEMOTONGAN ADALAHRANTAI DNA BERUJUNG GUGUS FOSFAT DAN UJUNG LAINNYA OH

UJUNG HASIL PEMOTONGAN: 1) UJUNG LENGKET (STICKY END) DAN 2) UJUNG TUMPUL (BLUNT END)

SEKUEN PENGENAL

EcoRI 5’ -------G * A – A – T – T – C --------------------------- 3’

3’ -------C – T – T – A – A * G --------------------------- 5’




5’ -------GOH PA – A – T – T – C ----------------------- 3’

3’ -------C – T – T – A – AP OHG ----------------------- 5’

SmaI 5’ -------C – C – C * G – G – G --------------------------- 3’

3’ -------G – G – G * C – C – C --------------------------- 5’




5’ -------C – C – COH PG – G – G ----------------------- 3’

3’ -------G – G – GP OHC – C – C ----------------------- 5’

SEKUEN PENGENAL

ENZIM RESTRIKSI

Gbr. Pemisahan DNA oleh enzim restriksi

VEKTOR / WAHANA KLONING

♦ SEUTAS MOLEKUL DNA TUNGGAL TEMPAT DILEKATKANNYA MATERIAL GENETIK YANG KITA INGINKAN SEBELUM DI INJEKSIKAN ATAUPUN DITRANSFORMASIKAN KEDALAM BAKTERI TERTENTU.

♦ WAHANA KLONING YANG PALING SERING DI GUNAKAN ADALAH PLASMID.




VEKTOR KLONING

VEKTOR KLONING

MOLEKUL DNA YANG DIPERLUKAN UNTUK MEMBAWA DAN SEKALIGUS MEMPERBANYAK DNA YANG DIBAWANYA

PLASMID MERUPAKAN SALAH SATU JENIS VEKTOR YANG PALING BANYAK DIGUNAKAN

PLASMID ADALAH MOLEKUL DNA UTAS GANDA, BENTUK MELINGKAR, BERADA DI LUAR KROMOSOM SEL

PLASMID DI ALAM BERUKURAN 1 KILO BASA (1000 PASANG BASA) S/D 200 KILO BASA

CIRI KHAS PLASMID ADALAH MEMPUNYAI ORI (ORIGIN OF REPLICATION), YAITU SITUS UNTUK MEMULAI REPLIKASINYA SENDIRI, SEHINGGA DALAM SEL MAMPU BEREPLIKASI/MENGGANDAKAN DIRI SENDIRI

BERDASARKAN SISTEM REPLIKASI ADA 2 GOLONGAN PLASMID: 1) REPLIKASI DI BAWAH KONTROL KETAT (STRINGENT CONTROL) DAN 2) REPLIKASI TERKONTROL SECARA LONGGAR/RILEKS (RELAXED CONTROL)

PLASMID YANG REPLIKASINYA DI BAWAH KONTROL KETAT REPLIKASINYA BERTEPATAN DENGAN REPLIKASI KROMOSOM SEL INANG

PLASMID YANG REPLIKASINYA TERKONTROL SECARA LONGGAR/RILEKS REPLIKASINYA INDEPENDEN DARI REPLIKASI KROMOSOM SEL INANG.

VEKTOR KLONING

VEKTOR KLONING

PLASMID YANG SEKARANG BANYAK DIPAKAI ADALAH PLASMID YANG TELAH DIMODIFIKASI (REKONSTRUKSI, DITAMBAH, DIKURANGI) SIFAT-SIFAT TERTENTU YG DAPAT MEMUDAHKAN PEKERJAAN KLONING DNA

PLASMID YANG BANYAK DIGUNAKAN ADALAH PLASMID YANG REPLIKASINYA SECARA LONGGAR, BERUKURAN RELATIF KECIL (2000 – 4000 PASANG BASA)

PLASMID BANYAK DIGUNAKAN DALAM KLONING DNA KARENA: 1) MUDAH DIMANIPULASI; 2) KUANTITASNYA BANYAK; 3) MEMPUNYAI MARKER UNTUK SELEKSI

KARAKTERISTIK PENTING PLASMID: 1) MEMPUNYAI ORI; 2) MEMPUNYAI MARKER SELEKSI (SELECTABLE MARKER); 3) MEMPUNYAI SITUS UNTUK KLONING (CLONING SITES)

VEKTOR KLONING

MARKER SELEKSI BERGUNA UNTUK PROSES SELEKSI, YAITU TAHAP UNTUK MENYELEKSI PLASMID YANG MEMBAWA DNA SISIPAN (REKOMBINAN) DARI PLASMID YANG TIDAK DISISIPI DNA ASING. MARKER SELEKSI YANG UMUM ADALAH GEN RESISTENSI TERHADAP ANTIBIOTIKA, MISALNYA AMPISILIN ATAU TETRASIKLIN

SITUS KLONING ADALAH TEMPAT/LOKASI DIMANA FRAGMEN DNA YANG AKAN DIKLON/GANDAKAN DIMASUKKAN/ DISISIPKAN UNTUK KEMUDIAN DIGANDAKAN OLEH PLASMID

SITUS KLONING ADALAH SATU SEGMEN PADA PLASMID YANG PANJANGNYA BEBERAPA PULUH SAMPAI RATUSAN PASANG BASA YANG TERDAPAT SEKUENS PENGENAL UNTUK BEBERAPA ENZIM RESTRIKSI

SEKUENS PENGENAL UNTUK ENZIM RESTRIKSI YANG ADA PADA SEGMEN SITUS KLONING INI HARUS SATU-SATUNYA DI TEMPAT ITU (TIDAK BOLEH ADA PADA BAGIAN LAIN DI SEKELILING MOLEKUL PLASMID)

PLASMID

ADALAH UNSUR GENETIK DILUAR KROMOSOM (EKSTRAKROMOSOMAL), YANG MENGADAKAN REPLIKASI SECARA AUTONOM DI DALAM SEL BAKTERI.

DNANYA BERBENTUK LINGKARAN DAN BERUNTAI GANDA.

MENDUKUNG GEN YANG DIPERLUKAN UNTUK REPLIKASI ATAUPUN FUNGSI LAIN YANG DIPIKULNYA.

PLASMID MUDAH DIPISAHKAN DAN DIMURNIKAN DARI DNA INANG

PADA RHIZOBIUM SP. PLASMID BERGUNA KARENA TERLIBAT DALAM PROSES FIKSASI DAN UNTUK MENGIKAT NITROGEN.




ADALAH MOLEKUL YANG DAPAT DITURUNKAN SECARA STABIL TANPA MENGKAITKANNYA DENGAN KROMOSOM.

SANGAT BERARTI BAGI BIDANG KEDOKTERAN , FARMASI, DAN PERTANIAN , KARENA PLASMID MEMBAWA RESISTEN TERHA DAP ANTIBIOTIK YANG BERGUNA BAGI MANUSIA DAN HEWAN.

SELAIN ITU DAPAT MENJANDIKAN TOKSIN DAN PROTEIN LAIN YANG DAPAT MENINGKATKAN VIRULENSI PATOGEN.

PLASMID

JENIS PLASMID

PLASMID F : BERFUNGSI DALAM PROSES KONJUGASI DAN DIKENAL PADA BERBAGAI BAKTERI.

PLASMID FAKTOR R : PLASMID YANG MEMBAWA GEN-GEN PENYEBAB RESISTENSI TERHADAP ANTIBIOTIK.

PLASMID TI :

PADA BERBAGAI AGROBACTERIUM

FUNGSI BERHUBUNGAN DENGAN TUMBUHAN INANG, YAITU DENGAN CARA MENTRANSFER SATU FRAGMEN DNA (DNA-T) KEDALAM SEL INANG, YANG KEMUDIAN AKAN MENYEBABKAN TUMBUHNYA TUMOR PADA INANG.

PLASMID

FUNGSI PLASMID

Mendukung replikasi

Sebagai vektor untuk pengklonan DNa

Pembawa gen resisten antibiotik ( plasma resisten )

Contoh : plasmid resisten  p BR. 322.( plasmid R.E Coli,

yaitu : plasmid yang memberi resisten terhadap

ampicilin dan tetrasiklin. )

♦ DNA plasmid dapat diisolasi dengan cara “melisiskan” sel bakteri dan memisahkan DNA plasmid dari DNA kromosom.

♦ Plasmid p.BR.322 : merupakan suatu determinan replikasi plasmid pMBI yang berkaitan dengan col.E.I. gen plasmid RI ( TN3) resisten dan gen resisten tetrasiklin plasmid pS (101) sebagai penanda seleksi.

PLASMID

PETA PLASMID

BAKTERI, BERPERAN DALAM PERBANYAKAN PLASMID MELALUI PERBANYAKAN BAKTERI

PEMINDAHAN PLASMID KEDALAM GEN

SITUS KLONING PADA PLASMID PUC19

Amp

pUC19

HaeII

HaeII

HaeII

GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGC

PstI

AccI

EcoRI

Hindiii

SphI

XbaI

BamHI

KpnI

SmaI

SalI

ENZIM LAIN DALAM KLONING

LIGASE ADALAH ENZIM YANG DIKETAHUI BEKERJA MENYAMBUNG FRAGMEN-FRAGMEN OKAZAKI PADA PERPANJANGAN UTAS LAGGING (LAGGING STRAND) DALAM REPLIKASI DNA

DALAM PROSEDUR KLONING DNA, LIGASE DIPERLUKAN UNTUK MENYAMBUNG FRAGMEN-FRAGMEN DNA YANG AKAN DIKLON DENGAN DNA VEKTOR

LIGASE MEMBUAT IKATAN FOSFODIESTER ANTARA OH DAN GUGUS P PADA UJUNG RANTAI DNA

ALKALINE PHOSPHATASE ADALAH ENZIM YANG DIGUNAKAN UNTUK MENGGANTIKAN GUGUS FOSFAT PADA SATU UJUNG DNA DENGAN GUGUS OH SEHINGGA MOLEKUL VEKTOR TIDAK DAPAT BERSIRKULASI SENDIRI

DNA POLYMERASE

POLINUKLEOTIDA KINASE

KULIAH KE-2

PROSES DASAR KLONING DNA

PROSES DASAR KLONING DNA

KLONING DNA PADA DASARNYA ADALAH MENGISOLASI DAN MENGGANDAKAN MOLEKUL DNA

1

3

2

4

Pemotongan DNA – enzim restriksi

Ligasi DNA fragmen dengan vektor

Transformasi DNA rekombinan ke E coli

Seleksi

Skema Proses Dasar Kloning DNA

PROSES DASAR KLONING DNA

SETELAH ISOLASI DAN PEMOTONGAN DNA DENGAN ENZIM RESTRIKSI, FRAGMEN-FRAGMEN DNA KEMUDIAN DISISIPKAN KEDALAM VEKTOR DENGAN MENGGUNAKAN ENZIM LIGASE (PROSESNYA DISEBUT LIGASI)

UNTUK MENINGKATKAN EFISIENSI PROSES SELEKSI DALAM TAHAP-TAHAP BERIKUTNYA, SEBELUM LIGASI, DNA VEKTOR YANG TELAH DIPOTONG ENZIM RESTRIKSI DIPERLAKUKAN DENGAN ALKALINE PHOSPHATASE

HASIL DARI PENYAMBUNGAN, YAITU KIMERA/KOMBINASI VEKTOR DENGAN DNA FRAGMEN DISEBUT MOLEKUL DNA REKOMBINAN

POPULASI DNA REKOMBINAN DENGAN FRAGMEN YANG BERBEDA-BEDA PADA MOLEKUL VEKTOR DISEBUT PUSTAKA (LIBRARY)

MOLEKUL DNA REKOMBINAN DITRANSFORMASI KE E COLI YANG KEMUDIAN DISEBARKAN DI DALAM PETRIDIS

MASING-MASING SEL E COLI YANG MENGANDUNG DNA REKOMBINAN AKAN TERUS MEMBELAH DIRI, SEHINGGA MASING-MASING MOLEKUL REKOMBINAN DIPERBANYAK (DIKLON)

DISAMPING ITU, MOLEKUL PLASMID VEKTOR YANG ADA DALAM SEL JUGA BEREPLIKASI, SEHINGGA DALAM SATU SEL TERDAPAT PERBANYAKAN KOPI MELEKUL DNA REKOMBINAN

SEHINGGA ADA DUA PERBANYAKAN. PELIPATGANDAAN MOLEKUL REKOMBINAN TERSEBUT DINAMAKAN KLONING DNA

SELEKSI ADALAH PROSES MENDAPATKAN DNA REKOMBINAN YANG MENGANDUNG FRAGMEN DNA SISIPAN YANG DIINGINKAN DIANTARA POPULASI REKOMBINAN (PUSTAKA) YANG ADA

SELEKSI MERUPAKAN TAHAPAN YANG PERLU USAHA PALING BANYAK DAN SULIT. UNTUK ITU PERLU STRATEGI DALAM PROGRAM KLONING DNA

PROSES DASAR KLONING DNA

Penyambungan DNA Fragmen Ke Dalam Plasmid

Dapat ditransformasi ke sel E. coli

dengan efisiensi tinggi

Efisiensi transformasi masih sangat rendah

Plasmid

DNA Asing

Phosphatase

DNA Ligase

EcoRI

Tidak dapat melingkar sendiri

OH

OH

OH

OH

OH

OH

OH

OH

OH

OH

OH

OH

OH

OH

OH

OH

P

P

P

P

KLONING GEN

Strategi Dalam Kloning DNA

Dalam rekayasa genetika, fragmen yang akan diklon adalah fragmen yang punya nilai strategis

Fragmen DNA yang diinginkan dapat berupa gen yang aktif mengendalikan sifat tertentu atau klon-klon DNA lain yang akan digunakan sebagai marker

Gen yang aktif berekspresi bekerja melalui pembuatan cetak mRNA, yang kemudian ditranslasi menjadi protein (enzim)

Transkripsi Translasi

DNA mRNA Protein

Transkripsi balik

Proses dasar genetik di atas yang banyak mendasari strategi dalam program kloning DNA

Program kloning DNA umumnya dimulai dengan mengisolasi mRNA dari tanaman

Dari mRNA yang berutas tunggal kemudian dibuat cetak DNA utas ganda yang disebut cDNA (complementary DNA)

Sintesis cDNA dari mRNA dikatalisis oleh enzim reverse transkriptase

cDNA lalu diligasi kedalam vektor, ditransformasi ke E coli untuk kemudian diseleksi

Populasi cDNA yang telah disisipkan ke dalam vektor dan ditransformasikan ke dalam sel E coli disebut pustaka cDNA (cDNA library)

Strategi Dalam Kloning DNA

Pustaka cDNA lebih menguntungkan daripada pustaka genom, karena diturunkan dari mRNA, sehingga hanya terdiri atas populasi sekuens-sekuens DNA yang aktif mengkode protein

Pustaka genom dibuat dari seluruh populasi fragmen DNA, sehingga selain mengandung sekuens yang berekspresi, juga ada sekuens lain, seperti sekuens kopi berulang

Strategi kloning DNA perlu disesuaikan dengan kondisi yang ada. Bila DNA yang ingin diklon berupa gen aktif yang mengkode protein, kondisi berbeda tersebut dapat berupa:

1) Protein atau produk dari gen yang diinginkan diketahui atau telah ada informasi tentang proteinnya

2) Protein belum diketahui atau tidak ada informasi tentang proteinnya

Kondisi berbeda tersebut memberikan implikasi pada strategi kloning, baik awal isolasi mRNA atau DNA, maupun pada proses seleksi pustaka

Bila protein telah diketahui, maka untuk mengklon gen dapat dimanfaatkan informasi tentang protein tadi, yaitu menganalisis sekuens asam amino dari protein tersebut, lalu mendeduksi dan mensintesis oligonukleotida kodonnya untuk digunakan sebagai probe dalam menyeleksi pustaka yang dibuat.

Strategi Dalam Kloning DNA

(6) (2) (4) (1) (4) (2) (2) (4) (2) (6)

NH2 ------- Leu Lys Gly Met Ala Glu His Val Tyr Arg ------ COOH

ujung amino ujung karboksilat

U

A A U U

(mRNA) 5’ AUG GCG GAG CAC GUA UA 3’

C G

C

A

T T A A

(DNA) 3’ TAC CGC CTC GTC CAT AT 5’

G C

G

A

B

C

Misal dari analisis sekuens asam amino, satu segmennya seperti di atas (A)

Dari rantai polipeptida, dipilih segmen yang punya kombinasi kodon Wobble yang paling sedikit (garis bawah)

mRNA yang mengkode polipeptida dapat dideduksi (B)

Kodon metionin (Met) satu (AUG), kodon alanin (Ala) ada 4 kemungkinan (GCU, GCA, GCG, GCC), kodon glutamin (Glu) ada 2 kemungkinan (GAA dan GAG)

Dari segmen polipeptida yang digarisbawahi ada 64 kemungkinan komposisi kodon mRNA

Dari sekuens mRNA lalu disintesis sekuens DNA komplementernya [C], yang kemudian digunakan sebagai probe untuk menyeleksi pustaka yang dibuat

Karena rantai DNA yang disintesis tersebut diturunkan dari urutan asam amino, maka sekuens tersebut akan sama dengan sekuens pada segmen kecil dari gennya.

Untaian DNA yang disintesis dari deduksi sekuens asam amino untuk kemudian dipakai sebagai probe dinamakan probe oligonukleotida

Strategi Dalam Kloning DNA

Bila tidak ada informasi yang diketahui tentang protein produk dari gen, maka ada beberapa pendekatan yang dapat dilakukan dalam proses kloning gen

Langkah awal yang bisa dijajagi adalah dengan menggunakan probe heterologous untuk menyeleksi pustaka yang dibuat

Hal ini dapat dilakukan bila gen sejenis dengan yang kita inginkan telah ditemukan atau diklon orang pada species tanaman lain

Contoh untuk mengklon gen waxy (wx) pada padi dapat digunakan klon gen waxy dari jagung (bila sebelumnya telah diklon)

Keberhasilan pemakaian probe heterologous bergantung pada jarak kekerabatan organisme

Strategi lain adalah Differential Screening. Pendekatan ini memanfaatkan prinsip dasar genetika tentang ekspresi gen, yaitu bahwa gen berekspresi dengan memproduksi mRNA

Disamping itu, prinsip ini berdasarkan pemahaman bahwa gen-gen tertentu akan berekspresi oleh stimulasi/induksi dari lingkungan

Prinsip dasar differential screening adalah gen yang diinginkan untuk berekspresi, lalu mRNA diisolasi untuk membuat pustaka cDNA yang kemudian diseleksi untuk mendapatkan gen khusus yang berekspresi oleh adanya induksi

Dalam seleksinya, metode ini dibantu dengan sintesis cDNA lain yang dibuat paralel, tetapi dari tanaman yang tidak diinduksi

Strategi Differential Screening

Tanaman Diberi Auksin

Tanaman Tidak Diberi Auksin

Isolasi Poli mRNA

Isolasi Poli mRNA

Sintesis cDNA

Sintesis cDNA

Ligasi ke Vektor dan

Transformasi Sel E. coli

Label cDNA (Probe)

Label cDNA (Probe)

Pustaka cDNA dalam Sel E. coli

Replika

Replika

Diprobe dengan cDNA

Yang Diinduksi Auksin

Diprobe dengan cDNA

Yang Tidak Diberi Auksin

X-ray Film

X-ray Film

Kandidat Klon Gen yang

Ekspresinya Diregulasi Auksin

Strategi Differential Screening

Tanaman Diberi Auksin

Tanaman Tidak Diberi Auksin

Poli mRNA

Sintesis cDNA

Ligasi dan

Transformasi

Label cDNA (Probe) - B

Auksin Spesifik mRNA

Pustaka cDNA

Replika dan

Membran Blot

X-ray Film

Posisi Koloni yang Mengandung Kandidat

Klon Gen Responsif terhadap Auksin

Label cDNA (Probe) - A

Probe

dengan A

Probe

dengan B

Strategi Metode PERT

Strategi/pendekatan lain adalah metode PERT - phenol emulsion reassosiation tenique

Prosedur PERT dimulai dengan mengisolasi DNA genom dari individu yang mempunyai kromosom lengkap (A) dan dari individu yang kromosomnya terdelesi (B)

DNA yang diisolasi dari A dipotong dengan enzim restriksi sehingga potongan yang dihasilkan mempunyai ujung lengket

DNA yang diisolasi dari B dipotong/dohancurkan dengan cara mekanis, misal dengan sonifikasi (getaran frekuensi tinggi), sehingga DNA hancur menjadi fragmen potongan kecil dengan ujung fragmen terputus acak tidak beraturan

DNA A dan B didenaturasi dan kemudian dihibridisasi

Dalam pencampuran perlu dilakukan adalah jumlah DNA B dicampurkan lebih banyak daripada DNA A (misal 100 x lebih banyak)

Intri strategi PERT: 1) ujung fragmen hasil pemotongan dan 2) kuantitas DNA yang dicampurkan saat hibridisasi

Dalam proses hibridisasi, sekuens DNA A yang punya sekuens komplementer dengan DNA B sebagian besar akan cepat berhibridisasi, karena jumlah DNA B yang banyak dalam larutan

DNA yang spesifik yang hanya ada dalam genom A dan tak ada di genom B, dalam waktu cukup lama akan berhibridisasi dengan utas pasangannya sendiri

Strategi Metode PERT

Hibridisasi dalam emulsi phenol akan menghasilkan 3 macam DNA utas ganda berdasarkan komposisi basa yang ada di ujung fragmennya:

1) fragmen yang ujungnya bekas putus mekanis (hasil hibridisasi sesama fragmen dari genom B)

2) Fragmen-fragmen yang satu utas bekas putus mekanis dan utas lainnya bekas pemotongan enzim (hasil hibridisasi A dan B)

3) Fragmen-fragmen yang ujung kedua utasnya merupakan hasil dari pe- motongan enzim restriksi (hasil hibridisasi sesama fragmen dari genom A)

Dalam proses selanjutnya (penyisipan fragmen DNA ke dalam vektor), fragmen 1 dan 2 tidak diterima oleh vektor karena ujungnya tidak dikenal oleh vektor dan tidak kompatibel untuk disambung

Hanya fragmen-fragmen dari golongan 3 yang dapat berligasi dengan vektor

DNA sisipan yang ada dalam pustaka hanya DNA-DNA dari jenis 3, dimana probabilitas sekuens spesifik yang dicari akan sangat besar porsinya

Pekerjaan seleksi diharapkan menjadi lebih mudah untuk mendapatkan klon yang diinginkan

Strategi Metode PERT

Individu Kromosom Lengkap

(Tanaman Spesies Liar) – A

Individu Kromosom Terdelesi

(Tanaman Terbudidaya) - B

Isolasi DNA Genom

Isolasi DNA Genom

Pemotongan dengan Enzim Restriksi

Pemotongan Mekanis (Sonifikasi)

Denaturasi

Denaturasi

Hibridisasi DNA Kedua Genom

Pada Emulsi Phenol

(Jumlah DNA B 100 DNA A)

Penyiapan Vektor

dengan

Enzim Restriksi

Replika

Replika

Seleksi dengan Menggunakan

Probe DNA Genom

Ligasi Kedalam Vektor

dan Transformasi

Strategi Metode PERT

Penyiapan Vektor dengan

Enzim Restriksi

DNA Padi Liar

(O. minuta)

DNA Padi Terbudidaya

(O. sativa)

Pemotongan dengan

Enzim Restriksi

Denaturasi

Hibridisasi Dalam

Emulsi Phenol

Transformasi

dan Seleksi

Sekuens spesifik

O. minuta yang dicari

Ligasi

BGMN. TRANSGENIK DIBUAT:
Riset Lab dan Lapangan bertahap.

Identifikasi sifat/karakter yg diinginkan

Identifikasi sumber gen

Isolasi gen dari sumbernya

Transfer gen ke tanaman/varietas sasaran

Uji karakter yg diinginkan: terekspresi?

Jika tdk, kembali ke langkah 4

BGMN. TRANSGENIK DIBUAT:
Riset Lab dan Lapangan bertahap.

Jika terekspresi,

Yakinkan bahwa tidak ada efek merusak

Gen berfungsi sbgmn diinginkan

Integrasi dg Pemuliaan Konvensional/ Pd waktu sama dg no. 7, lakukan Uji keamanan produk

Ajukan informasi ke Komisi Keamanan Hayati

UJI BIOSAFETY/FOOD SAFETY

RESISTENSI TANAMAN TERHADAP VIRUS

Target resistensi virus:

1) memberikan resistensi terhadap transmisi (resistensi terhadap vektor, nonpreferensi vektor, resistensi terhadap transmisi benih)

2) resistensi untuk perkembangan penyakit (pencegahan replikasi virus, pencegahan penyebaran virus dari sel ke sel lainnya dalam tanaman)

3) resistensi terhadap perkembangan gejala penyakit (toleran)

Hambatan pemuliaan konvensional adalah sulitnya mencari sumber gen. Gen resistensi kerapkali ditemukan pada kerabat liar, akan tetapi ada masalah dengan kompatibilitas (gen resistensi tidak termanfaatkan)

Hambatan lain, resistensi yang didapat kerapkali hancur kembali karena resistensi dikendalikan oleh satu gen. Contoh ketahanan padi terhadap virus tungro yang telah diperoleh melalui resistensi terhadap vektornya, tetapi resistensi hancur dengan adanya biotipe baru vektor tersebut

Pendekatan lain, teknologi rekombinan DNA. Sanford dan Johnston (1985) memperkenalkan konsep baru penggunaan rekayasa genetika dalam mengembangkan resistensi terhadap mikroorganisme. Mereka menyarankan bahwa gen yang sudah dimodifikasi dari suatu patogen dapat memberikan resistensi tanaman dengan mengganggu proses hidup patogen tersebut (resistensi nonkonvensional terhadap penakit virus tanaman)

RESISTENSI TANAMAN TERHADAP VIRUS

Ada tiga bentuk resistensi nonkonvensional terhadap virus yang sudah dicobakan: 1) penggunaan sekuens RNA satelit, 2) sekuens RNA antisense, 3) gen penyandi protein pembungkus virus (virus coat protein gene – gen VCP)

RNA satelit adalah RNA berukuran kecil yang dapat bereplikasi menjadi sangat banyak. Tidak diperlukan dalam perbanyakan partikel virus dan tidak mempunyai homologi sekuens dengan RNA genom virus.

Ekspresi RNA satelit virus dalam tanaman transgenik menunjukkan penurunan gejala serangan virusnya sendiri. Pada beberapa kasus, menurunkan laju replikasi virus

Perlindungan tanaman menggunakan sekuens satelit ini spesifik hanya terhadap jenis virus asalnya

Sekuens RNA antisens virus digunakan untuk mendapatkan resistensi terhadap serangan virus pada tanaman belum banyak dilaporkan. Dari laporan yang ada belum terlihat keberhasilan yang konsisten

Gen panyandi protein pembungkus virus telah dibuktikan efektif memberikan proteksi terhadap serangan beberapa jenis virus

Metode yang dilakukan adalah dengan mengklon gen virus yang menyandi protein pembungkus partikel virus tersebut. Gen ini digabungkan dengan suatu sekuens pengendali (promotor) dan ditransformasikan ke dalam tanaman

Bila gen VCP diekspresikan, maka dalam tanaman akan terjadi akumulasi protein pembungkus virus. Telah terbukti bahwa resistensi tembakau terhadap TMV disebabkan oleh akumulasi protein pembungkus, bukan karena RNA transkripnya

Studi menunjukkan bahwa mekanisme resistensi tersebut berperan pada tingkat awal proses replikasi virus, dengan menghalangi proses replikasi virus secara tak terkendali dari partikel virus

RESISTENSI TANAMAN TERHADAP HERBISIDA

Herbisida digunakan untuk menekan pertumbuhan gulma pada tanaman pertanian

Herbisida sekarang memiliki gabungan sifat yang menguntungkan, seperti: efektifitas tinggi, tidak toksik, dan mengalami biodegradasi cepa. Namun, sering tidak memiliki selektivitas, sehingga menghalangi penggunaannya secara preemergence

Cara kerja herbisida satu dengan lainnya berbeda cara kerjanya.

Herbisida menghambat proses fotosintesis. Contohnya kelompok Atrazin dan Bromoxynil. Kelompok herbisida ini membunuh gulma dengan cara mengganggu transpor elektron fotosintesis dapa fotosistem II, dengan mengganggu pengikatan plastoquinon pada protein QB, yaitu suatu protein hidrofobik yang melekat pada membran tilakoid kloroplas. Protein tersebut dihasilkan oleh gen psbA, sebuah gen yang ada di kloroplas

Herbisida menghambat biosintesis asam amino. Contohnya glyphosate, phosphinotricin, sulfonylurea, imidazolinon

Glyphosate adalah jenis herbisida yang sekarang paling banyak digunakan, tidak beracun bagi hewan, dan dapat segera terurai oleh mikroorganisme tanah. Herbisida ini bekerja dengan menghambat enzim 5-enol-pyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS)

Phosphinotricin (PPT) adalah sebuah analog dari glutamin. PPT menghambat suatu enzim yang terlibat dalam biosintesis asam amino, yaitu gltamine synthase (GS). Dalam tanaman GS terlibat proses asimilasi amonia dari reduksi nitrat, fotorespirasi, atau fiksasi N2 akar. Enzim GS juga berperan regulasi metabolisme N

Sulfonylurea dan imidazolinon (keduanya dari grup berbeda) sama-sama menghambat enzim acetolactat synthase (ALS). Enzim ALS terlibat dalam biosintesis asam amino bercabang, seperti leusin, isoleusin, dan valin

Target Herbisida: Jalur Biosintesis Asam Amino

Glucose

Alanine

Phosphoribosyl

Pyrophosphate

3-phosphoglycerate

Phosphoenolpyruvate

Pyruvate

Histidine

Aminotriazole

Denaturasi

Denaturasi

Denaturasi

Glyphosate

Tryptophan

Tyrosine

Phenylalanine

Glycine

Cysteine

Serine

Leucine

Valine

Isoleusine

Lysine

Threonine

Methionine

Oxaloacetate

Aspartate

Aaparagine

-ketoglutarate

Glutamate

Phosphinocitrin

Arginine

Proline

Glutamine

Sulfonylureas

Imidazolinone

Triazolopyrimidine

RESISTENSI TANAMAN TERHADAP HERBISIDA

Perkembangan teknologi rekombinan DNA memungkinkan manipulasi rekayasa genetika untuk mendapatkan tanaman yang toleran terhadap herbisida

Menurut Oxtoby dan Hughes (1990), metode untu merekayasa resistensi tanaman terhadap herbisida dapat dibedakan ke dalam dua kelompok pendekatan: 1) merubah tingkat sensitivitas dari enzim yang merupakan target herbisida dalam tanaman dan 2) mengintroduksi gen pengkode enzim yang dapat menetralisir (menghilangkan) sifat racun herbisida di dalam tanaman

Herbisida Atrazin. Pendekatan enzim target untuk herbisida Atrazin telah dilakukan dengan memanfaatkan gen mutan yang timbul spontan pada tanaman atau bakteri yang ditemukan di alam

Analisis protein QB dari tanaman mutan resisten menunjukkan adanya substitusi pada satu asam amino dibanding QB tipe awal

Kendala yang dihadapi dalam menciptakan tanaman transgenik menggunakan gen mutan adalah sulitnya mengintroduksi gen ke dalam genom kloroplas

Untuk mengatasi kesulitan teknis tersebut, dalam suatu program, gen mutan psbA dari Amaranthus hybridus dikonversi menjadi gen nukleus dengan menggabungkan sekuens pengkode polipeptidanya dengan sekuens regulasi transkripsi dan sekuens peptida transit gen nukleus

Gen kimera tersebut sewaktu dimasukkan ke dalam genom tanaman tembakau dengan bantuan Agrobacterium menghasilkan protein yang dapat diidentifikasi pada kloroplas tanaman tembakau yang ditransformasi

Tanaman transgenik tersebut toleran terhadap herbisida Atrazin, menunjukkan bahwa protein hasil psbA yang ditranspor berfungsi dalam proses fotosintesis

RESISTENSI TANAMAN TERHADAP HERBISIDA

Herbisida Glyphosate. Resistensi terhadap Glyphosate telah dihasilkan, baik melalui introduksi gen mutan penghasil enzim EPSPS atau dengan ekspresi gen untuk memproduksi enzim tersebut secara berlebihan

Sebuah gen AroA yang menghasilkan enzim EPSPS telah diklonkan dari bakteri Salmonella typhimurium. Tanaman tembakau dan tomat transgenik yang mengandung gen tersebut toleran terhadap Glyphosate

Bahasan di atas adalah pendekatan enzim target

Pendekatan melalui penetralan sifat racun juga sudah banyak dilakukan

Gen penghasil enzim yang mampu menetralisir efek racun herbisida, seperti oksidase, amidase, atau dekarboksilase yang memberikan resistensi herbisida telah diidentifikasi pada beberapa jenis tanaman dan bakteri

Sistem yang telah dipelajari secara intensif adalah konjugasi senyawa xenobiotik dengan glutathione yang dikatalisis oleh enzim multifungsi glutathione-S-transferase (GST)

GST menetralisir Atrazin (gen GSTI) dan Alachlor (gen GSTIII) telah diisolasi dari tanaman jagung

Gen bxn telah diisolasi dari plasmid bakteri tanah Klebsiella ozaenoe

Gen bxn menghasilkan enzim nitrilase yang mengkonversi herbisida bromoxynil (3,5-dibromo-4-hydroxybenzonitrile) yang mengambat fotosintesis menjadi senyawa metabolit tidak aktif (3,5-dibromo-4-hydroxybenzoat)

Klon gen bxn elah diransformasikan ke tembakau dan tomat dan menunjukkan ekspresi toleran terhadap bromoxynil

RESISTENSI TANAMAN TERHADAP HERBISIDA

Gen bar dari Streptomyces hygroscopicus juga telah diklon dan dikarakterisasi

Gen bar tersebut menghasilka enzim phosphinotricin acetyl transferase (PAT) yang mengkonversi phosphinotricin menjadi senyawa terasetilasi yang tidak toksik

Telah ditransformasikan ke tembakau, kentang, dan tomat dan menunjukkan resistensi terhadap herbisida tersebut

Sifat resisten terhadap Atrazin telah pula dilakukan melalui persilangan konvensional dan fusi protoplas terhadap species-species Brassica dan menunjukkan hasil yang baik, namun kultivar yang dihasilkan menunjukkan penurunan produksi hingga 30%

RESISTENSI TANAMAN TERHADAP SERANGGA


Bacillus thuringiensis (bt) adalah bakteri yang menghasilkan suatu protein kristal yang bersifat racun terhadap serangga

Aktivitas bioinsektisida bt tersebut spesifik terhadap species serangga tertentu dan tidak toksik terhadap hewan

Dari lebih 3.000 isolat alam bt yang telah diseleksi oleh Plant Genetic System N.V. Belgium, menunjukkan hampir semua merupakan racun terhadap larva berbagai Lepidoptera dan 5 terhadap larva Coleoptera

Isolat yang dimiliki IIRI Pilipina sebanyak 4.000, telah diidentifikasi sekitar 40 jenis/kombinasi toksin

Gen penghasil toksin pada bt pertama kali diklon tahun 1981

Sejak saat itu lebih dari 13 gen penghasil toksin telah diklon dari berbagai macam isolat bt dan B. sphaericus

Tembakau, tomat, dan kentang transgenik yang mengandung gen toksin bt memperlihatkan resistensi terhadap serangga

Bacillus thuringiensis (Bt)

Nama Gen Cry

Toksik thd

CryIA(a), CryIA(b), CryIA(c)


Lepidoptera

CryIB, CryIC, CryID

Lepidoptera

CryII

Lepidoptera, Diptera

CryIII

Coleoptera

CryIV

Diptera

*bakteri tanah yg sporanya mengandung Crystalline (Cry) protein. Bila serangga memakan-» protein pecah menjadi delta-endotoxin shg keracunan.
* sudah lama digunakan sbg insektisida (Dipel, Thuricide)

Tan. Transgenik:
berdasarkan Karakter, 2000

Karakter Gen

%

Toleran Herbisida

74

Tahan Serangga (Bt)

19

Bt + Tol. Herbisida

»6%

Tahan Virus

«1%

GENERASI I: Proteksi Tanaman

Jagung Transgenik

Tahan Corn Borer

Tahan Herbisida

Tahan Root Worm

Kapas Transgenik ‘BollGard’

Mengandung ‘insecticidal protein’ dr Bacillus thuringiensis, subsp. kurstaki (B.t.k.) yg melindungi kapas dr hama serangga Lepidoptera ttt.

Hama sasaran:

tobacco budworm (Heliothis virescens)

pink bollworm (Pectinophora gossypiella).

cotton bollworm (Helicoverpa zea), scr umum tahan

Transgenik pertama di Indonesia

Teknologi (impor) dr Monsanto


Transgenik Generasi II

Tanaman toleran kekeringan, tanah masam

Tomat tahan simpan, tahan bakteri, tinggi vit. A

Golden Rice, mengandung vit A

Canola dg vit. E dan kandungan asam lemak seimbang

Rumput taman/golf tahan herbisida dan kering

Pisang mengandung vaksin virus

ads.com